• 病毒RNA提取實(shí)驗(yàn)

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    病毒RNA提取實(shí)驗(yàn)


    病毒RNA提取可以：（1）用于RNA病毒復(fù)制機(jī)制研究；（2）用于反向遺傳學(xué)研究；（3）用于分子病毒學(xué)其他研究。

    詳細(xì)

    實(shí)驗(yàn)方法

    實(shí)驗(yàn)方法

    • TE-飽和酚/氯仿提取法

    實(shí)驗(yàn)方法原理大多植物病毒RNA 為單鏈RNA ，并且其極性與mRNA 極性相同，植物病毒RNA 提取較為簡(jiǎn)單，一般使用酚氯仿即可獲得滿(mǎn)意結(jié)果。 
    實(shí)驗(yàn)材料
    試劑、試劑盒
    儀器、耗材
    抗體
    實(shí)驗(yàn)步驟
    一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

    1.  材料
     
    提純TMV病毒液（10 mg/ml）。
     
    2.  設(shè)備
     
    冷凍臺(tái)式離心機(jī)，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。
     
    3.  試劑
     
    TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3 M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無(wú)RNA 酶的雙菌水。
     
    二、操作步驟
     
    1.  取一eppendorf管加入提純TMV（10 mg/ml)400 ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12 000 g離心10分鐘。
     
    2.  吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機(jī)相交界面無(wú)蛋白為止。
     
    3.  吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4℃下12 000 g離心10分鐘。
     
    4.  取水相，加入1/10倍體積的3 mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。
     
    5.  4℃下12 000 g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12 000 g離心5分鐘。
     
    6.  小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無(wú)RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。
     
    7.  取10 ml進(jìn)行電泳分析。
     
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    注意事項(xiàng)
    1.  整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。
     
    2.  由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍�，一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提。

     

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